Y_CHR_Pferd

Eine vergleichende Sequenzierung großer Regionen des Y-Chromosoms soll die eindeutige genetische Charakterisierung von Hengstlinien österreichischer Pferdrassen ermöglichen. Im beantragten Projekt möchten wir durch Kombination aus gezieltem Anreichern bestimmter, gut sequenzierbarer Regionen des Y-Chromosoms mittels „target enrichment“ und NGS Sequenziertechnologie polymorphe Y-chromosomale DNA Marker identifizieren die eine individuelle Charakterisierung der Hengststämmen der österreichischen Pferderassen ermöglichen.

Die einzelnen Ziele des beantragten Projektes sind:
Z1: Eindeutige Charakterisierung der Hengststämme österreichischer Pferderassen (Lipizzaner, Noriker, Haflinger, Shagya Araber, Österreichisches Warmblut und Altösterreichisches Warmblut) mit Y-chromosomalen DNA Markern.
Z2: Entschlüsselung der Herkunft der Gründerhengste und Untersuchung der Verwandtschaftsbeziehungen zwischen den Hengststämmen
Z3: Untersuchung der Verbreitung der identifizierten Y-chromosomalen Haplotypen in der österreichischen Pferdepopulation.

Um die Ziele zu erreichen werden im ersten Arbeitsschritt (Z1) von 192 Hengsten Y-chromosomale Regionen aus DNA Proben, in Summe etwa 1,7 MB mittels \"target-enrichment\" angereichert (Gnirke et al. 2009). Diese Art der Anreicherung stellt bereits eine Standardtechnik zur Sequenzierung von ausschließlich proteinkodierenden Regionen („Exome Sequencing“) dar (Bamshad et al. 2011). Für das Projekt werden eigens dafür synthetisierte „Capture-baits“ hergestellt, die eine Anreicherung von Y-chromosomalen Sequenzen vor dem Sequenzierschritt ermöglichen. Der Anreicherungsschritt reduziert die Komplexität der DNA-Probe und somit die Sequenzierkosten. Das Anreicherungsprodukt wird dann mit NGS Technologie sequenziert. Nach Auswertung der Sequenzdaten und Identifikation von Haplotypen, werden die phylogenetischen Beziehungen zwischen den Hengststämmen rekonstruiert (Z2). Um die Herkunft der Hengststämme abzuklären werden auch die Y-chromosomalen Haplotypen von etwa 60 Hengsten anderer Rassen ermittelt. Dieser Vergleich liefert wichtige Informationen zur Einschätzung der genetischen Wurzeln der österreichischen Wurzeln. (Z3) Zuletzt werden für die NRY Polymorphismen SNP-Assays generiert, mit denen die Verteilung der ermittelten Haplotypen in einer für die Gesamtpopulation repräsentativen Stichprobe überprüft wird.
Bamshad MJ, Ng SB, Bigham AW, Tabor HK, Emond MJ, et al. (2011) Exome sequencing as a tool for Mendelian disease gene discovery. Nat Rev Genet 12: 745-755.
Gnirke A, Melnikov A, Maguire J, Rogov P, LeProust EM, et al. (2009) Solution hybrid selection with ultra-long oligonucleotides for massively parallel targeted sequencing. Nat Biotechnol 27: 182-189
Hallast P, Batini C, Zadik D, Maisano Delser P, Wetton JH, et al. (2015) The Y-Chromosome Tree Bursts into Leaf: 13,000 High-Confidence SNPs Covering the Majority of Known Clades. Mol Biol Evol 32: 661-673.

Bislang konnten nur Stutenfamilien über mitochondriale DNA-Sequenzen charakterisiert werden. Weil aber gerade Hengste in der Pferdezucht als die Säulen des Zuchtfortschrittes anzusehen sind, stellt die molekulargenetische Beschreibung der Hengststämme eine wichtige Ergänzung, komplementär zu den Untersuchungen von Stutenlinien, dar. Gute Pedigreeaufzeichnungen lassen zwar den Einfluss und die Herkunft einzelner Gründerhengste in vielen Rassen oft bis in das 18. Jahrhundert zurückverfolgen, genetische Daten ermöglichen aber eine Rekonstruktion der heute existierenden Hengststämme wenn Zuchtbuchaufzeichnungen nicht ausreichen oder fehlerhaft sind. Die erhobenen Daten werden als Grundlage für züchterische Maßnahmen zur Erhaltung einzelner Hengstlinien dienen. Auch zukünftige Arbeiten werden von den Resultaten profitieren, da die Analyse von Y-Chromosomenvarianten vor allem bei Rassen mit unklarer Vergangenheit wichtige Informationen über die Zuchtgeschichte liefern kann - diese aber nur durch Abgleich mit fundierten Linien interpretierbar macht. Generell können die ermittelten Marker auch wirtschaftlich eingesetzt werden, um in forensischen Fragestellungen weit zurückreichende, väterliche Stammbäume zu überprüfen.

MÄNNLICHE TIERE VERERBEN IHR Y-CHROMOSOM beinah unverändert an ihre Söhne weiter. Das ermöglicht eine genetische Rekonstruktion der männlichen Abstammungslinie, was die schriftlichen Aufzeichnungen in Zuchtbüchern komplementieren kann. Beim Pferd ist die Variabilität am Y-Chromosom jedoch so gering, sodass väterliche Abstammungen bislang schwer nachvollziehbar waren. Im Rahmen dieses Projektes wurden Methoden etabliert mit denen unter Einsatz von Hochdurchsatz-Sequenziertechniken die Verwandtschaftsbeziehungen der Hengststämme der Rassen Lipizzaner, Noriker und Haflinger genetisch entschlüsselt werden konnten. Waren in früheren Arbeiten bereits arabische und englische Vollblutlinien im Fokus kann nun auch die historische Entwicklung der Hengststämme von Lipizzaner, Noriker und Haflinger unabhängig von Zuchtbucheintragungen nachvollzogen werden. Die Lipizzanerhengststämme spiegeln eindeutig die bewegte Geschichte der Rasse wider. Der Einfluss von spanischen, zentraleuropäischen und arabischen Zuchten wird in den Hengststämmen des Lipizzaners sichtbar. Sogar ein englischer Vollbluthengst dürfte sich in einem Hengststamm des Lipizzaners verewigt haben. Die Hengstlinien von Noriker und Haflinger gehen auf ganz andere Y-chromosomale Ursprungslinien zurück als die Hengststämme des Lipizzaners. Die Noriker und Haflingerlinien gruppierten gemeinsam zentraleuropäischen Kaltblutpferden und iberischen Linien. Weder beim Noriker noch beim Haflinger konnte ein nennenswerter Einfluss von arabischen Linien beobachtet werden. Die Ergebnisse deuten somit darauf hin, dass sich die Hengstlinien von Noriker und Haflinger aus regionalen Pferdepopulationen des Alpenraumes entwickelt haben. Weiters waren die Y-Linien von Noriker und Haflinger trotz ihrer genetischen Ähnlichkeit klar unterscheidbar, was gegen eine kurz zurückliegende Vermischung der Rassen auf väterlicher Seite spricht. Die gewonnenen Erkenntnisse aus diesem Projekt ermöglichen weitere detaillierte Studien zum väterlichen Ursprung von Pferden und anderen Haustieren. Die ermittelten genetischen Marker können für forensische Zwecke genutzt werden.