Projekt-85: Entwicklung und Einsatz eines Multi-Substrat Enzymessays (MSEA) zur Bestimmung von bodenenzymatischen Umsetzungsraten unter In-Situ-Verhältnissen

Schwerpunkt dieser Arbeit war die Entwicklung und Adaptierung eines neuartigen Multi-Substrat Enzymassays (MSEA), der die Bestimmung von mehreren Bodenenzymen in einem einzigen Assay erlaubt. Anhand ausgewählter Bodenproben von unterschiedlichen Versuchstandorten wurde die optimale Substratzusammensetzung und -konzentration für landwirtschaftlich genutzte Böden ermittelt. Als künstliche Substrate wurden 4-Methylumbelliferon- und 7-Amino-4-methylcoumarin-Derivate eingesetzt. Im Gegensatz zu herkömmlichen Enzymassays wurde nicht die Produktbildung, sondern der Abbau der zugesetzten Substrate zur Kalkulation der Enzymaktivität herangezogen. Die zugesetzten Substrate wurden nach erfolgter Inkubation extrahiert, mittels HPLC aufgetrennt und via UV-Detektion (320 nm) quantifiziert. Auf diese Weise konnten die Bodenenzyme ß-Glucosidase, N-Acetyl-ß-glucosaminidase, ß-Xylosidase, ß-Glucuronidase, Phosphatesterase und Leucin-Aminopetidase in einem Arbeitsschritt in ausreichender Genauigkeit ermittelt werden. Die Zusammensetzung des MSEA ist variabel, sodass auch andere Enzyme bei adäquater Veränderung des Substratspektrums ermittelt werden können. Der Vergleich der Bodenenzymaktivität von elf Versuchsböden ergab eine weitgehende Übereinstimmung der Ergebnisse ermittelt nach Standardverfahren bzw. mit Hilfe des MSEA, beide Ansätze führten zu ähnlicher Differenzierung der ausgewählten Versuchsböden. Unterschiedliche Enzymaktivitäten zwischen Standardmethode und MSEA ergaben sich in erster Linie durch den Einsatz unterschiedlicher Substrate, unterschiedlicher Extraktionsausbeuten sowie durch verschiedene pH-Werte und Temperaturen während der Inkubation. Zusätzlich konnten bei manchen Enzymen kompetitive Inhibitationseffekte durch stereochemisch ähnliche Substrate festgestellt werden. Die Ermittlung der in-situ Enzymaktivität (Bestimmung der Enzymaktivität bei Boden-pH und Boden-Temperatur) der elf Versuchsböden mittels MSEA erbrachte nur unwesentliche Abweichungen von pH-gepufferten Systemen. Da viele Hydrolasen ein pH-Optimum von etwa 5-6 aufweisen, liegen die Umsetzungsraten der einzelnen Enzyme, deren Aktivität außerhalb des optimalen pH-Wertes ermittelt wurde, nur unwesentlich unter denen bei pH-Optimum. Zusätzliche Temperatursteigerungsversuche führten zu dem Ergebnis, dass bei den meisten untersuchten Enzymaktivitäten pro 10 °C Temperaturerwärmung etwa eine Verdopplung der Umsetzungsrate eintritt, sodass auch mit Inkubationen bei höheren Temperaturen (etwa 30 °C) auf die Enzymaktivität bei geringeren Temperaturen geschlossen werden kann.