Projekt-47: Laserflugzeitmassenspektrometrie zur Charakterisierung von Lipiden unter besonderer Berücksichtigung von Pflanzenöltriacylglycerolen in Zusammenhang mit familiärer Hypercholesterinämie

Lipide erfüllen viele wichtige Zellfunktionen wie z.B. als Energiespeicher (Triglyceride), Strukturkomponenten (Glycerophospho- und Glykolipide) und Signaltransduktoren (Diglyceride, Sphingosine und Ceramide). Biologische Proben enthalten meist eine komplexe Mischung aus strukturell sehr unterschiedlichen Lipiden. Die Zusammensetzung dieser Moleküle spielt eine entscheidende Rolle in normalen Zellfunktionen und wird von verschiedensten Faktoren beeinflusst. Fette und Öle aus der pflanzlicher Nahrung stellen eine wesentliche Quelle von Lipiden in der menschlichen Ernährung dar. Aufgrund der einfachen Anwendbarkeit können die massenspektrometrischen Techniken (ESI- sowie APCI-Massenspektrometrie und insbesonders MALDI-Flugzeitmassenspektrometrie) als universelle Analysetechniken für Lipide eingesetzt werden. Ein wesentlicher Teil dieser Studie befasste sich mit der Ausarbeitung einer für Lipide geeigneten MALDI-MS-Probenpräparation. Im Rahmen unserer Untersuchungen wurden dabei verschiedenste Matrixsysteme für ihre Anwendbarkeit in der Lipidanalyse evaluiert. In der Analyse von Triacylglycerolen (TAGs) aus pflanzlichen Ölen wurde erstmals ein flüssiges, binäres Matrixsystem bestehend aus Natriumhexacyanoferrat(II)/Glycerin erfolgreich eingesetzt. Ein entscheidender Vorteil gegenüber allen anderen untersuchten Matrices war dabei die exklusive Generierung von [M+Na]+ Molekülionen, was vor allem die Analyse von komplexen TAG-Mischungen sehr vereinfacht. In der Analyse von unaufgetrennten pflanzlichen Ölen konnten ölspezifische TAG-Muster eindeutig nachgewiesen werden. Es wurden dabei folgende ernährungsrelevante Öle untersucht und deren charaktistisches TAG-Muster schnell und hochempfindlich bestimmt: Rapsöl, Kürbiskernöl, drei Sorten von Sonnenblumenkernöl, Haselnussöl, Olivenöl, Sojaöl und Macadamianussöl. Die PSD-Fragmentionenanalyse von selektierten TAG-Molekülionen ermöglichte dabei die eindeutige Bestimmung der Fettsäurezusammensetzung aufgrund spezifischer Fragmentionen. Diese lieferten Informationen sowohl über die Kettenlänge, als auch den Sättigungsgrad der Fettsäurereste. Aufgrund der guten Reproduzierbarkeit der MALDI-Massenspektren, war nicht nur ein qualitativer sondern auch ein semiquantitativer Nachweis der TAGs in den verschiedenen Pflanzenölen möglich. Eine online Analyse, basierend auf einer Auftrennung der TAGs mittels RP-HPLC und anschließender Sprayionisation, ermöglichte den Nachweis der einzelnen TAGs (einschließlich zahlreicher Nebenkomponenten) in allen untersuchten Pflanzenölen. Dabei zeigte sich, dass die eingesetzten 'weichen' Ionisierungsmethoden, Sprayionisation (ESI und APCI) und MALDI, komplementäre Informationen liefern und unterschiedliche Qualitäten aufweisen. MALDI zeigte die höchste absolute Nachweisempfindlichkeit, wohingegen die Sprayionisationstechniken die meisten Strukturinformationen liefern konnten. Der quantitative Vergleich der TAG-Zusammensetzung von unaufgetrennten pflanzlichen Ölen zwischen ESI- und MALDI-Technik ergab übereinstimmende Daten. Bei der MALDI-MS-Untersuchung der anderen unterschiedlichen Lipidklassen zeigte sich, dass 2,4,6-Trihydroxyacetophenon (THAP) als eine universelle Matrix im Lipidbereich eingesetzt werden kann. Dabei konnten besonders Glycerophospho- (GPLs), Sphingo- (SLs) und Glycolipide (GLs) mit höchster Sensitivität nachgewiesen werden. Weiters konnte gezeigt werden, dass THAP besonders gut für Alkalisalzdotierungsexperimente geeignet ist, wodurch die Komplexität der MALDI Massenspektren im Detektionsmodus für positive Ionen wesentlich verringert werden konnte. Dies ist besonders ein Vorteil bei der Untersuchung von komplexen Lipidmischungen (z.B. humane Plasmalipidproben). Mittels PSD-Fragmentionenanalyse dieser Alkaliaddukte konnte eine Bestimmung der Klassenzugehörigkeit der verschiedenen Phospholipide durchgeführt werden. Zusätzlich konnte die Stellung der Acrylsubstituenten (sn-1(gamma) und sn-2(beta) Position) am Glycerin aufgrund von Intensitätsunterschieden der entsprechenden Fragmentionen bestimmt werden. Dabei konnte eine bevorzugte Abspaltung der Fettsäuren aus sn-1 Position beobachtet werden, was eine Identifizierung von stellungsisomeren Molekülen möglich macht. In der Analyse von komplexen Lipidfraktionen aus humanem Serum ist die chromatographische Auftrennung der unterschiedlichen Lipidklassen eine wesentliche Voraussetzung für eine erfolgreiche Charakterisierung der Einzelkomponenten der jeweiligen Klassen. Dabei stellte sich als ideale Strategie die Lipidklassentrennung mittels Dünnschichtchromatographie, die anschließende Mikroextraktion und die nachfolgende MALDI-MS Analyse heraus. Sowohl qualitative als auch semiquantitative Aussagen über die einzelnen Lipidklassen (isoliert aus Humanblut) konnten gemacht werden. Somit konnte eine wenig aufwendige, hochsensitive und rasche Methode zur Untersuchung von komplexen Lipidmischungen in Humanblut etabliert werden.