Projekt-46: Entwicklung einer Strategie zur Analytik von Steroidhormonen und nichtsteroidalen Hormonen (Stilbenen) in Futtermitteln sowie unterschiedlichen biologischen Matrices
Projektleitung
Walter Welz
Forschungseinrichtung
GOREON - Bioanalytisches Laboratorium
Projektnummer
1162Projektlaufzeit
-
Finanzierungspartner
Bundesministerium für Land- und Forstwirtschaft, Umwelt und Wasserwirtschaft
Navigation
Allgemeine Projektinformationen
Projektziele
Steroidale und nichtsteroidale Hormone (Stilbene) spielen in der Tiermast, speziell der Rindermast, zur Fleischertragssteigerung trotz gesetzlichem EU-weiten Verbot eine nicht unwesentliche Rolle. Mit der Entwicklung immer neuerer (semi)synthetischer Derivate mit immer besserer oraler Wirksamkeit ergibt sich die Notwendigkeit, auch in der Tiermast zum Einsatz kommende Futtermittel sowie Körperflüssigkeiten und Produkte auf Hormone zu untersuchen. Die potentiell zum Einsatz kommenden Stoffe umfassen Estrogene (Estradiol und verwandte Verbindungen, Stilbene), Gestagene (Derivate des Progesterons, Derivate des 17a-Ethinylnortestosterons) und Androgene/Anabolica (beide: Derivate des Testosterons). Im Gegensatz zur Analytik von Fleisch, wo die Probenvorbereitung nach etablierten Verfahren abläuft und die Endbestimmung mittels GC/MS (nach aufwendigen Derivatisierungsprozeduren) oder neuerdings mittels LC/MS durchgeführt wird, gibt es für Futtermittel weder eine Liste potentiell in Frage kommender Analyten noch entsprechende Vorschriften für Probenvorbereitung und Enddetektion.
Entwicklung einer Analysenstrategie zum Nachweis von Hormonen in Futtermitteln sowie in verschiedenen biologischen Matrices (Fleisch, Serum, Urin), bei der die Superkritische Fluidextraktion als auch die Festphasenextraktion sowie die Flüssig/Flüssig-Extraktion als Probenvorbereitung dient, Dünnschichtchromatographie bzw. zweidimensionale Hochleistungsflüssigchromatographie mit UV-Detektion als Screeningmethode und On-line-LC/MS als Konfirmationsmethode zum Einsatz kommen. Die Methode soll in der Folge Kontrollaktivitäten zur Verfügung stehen.
Entwicklung einer Analysenstrategie zum Nachweis von Hormonen in Futtermitteln sowie in verschiedenen biologischen Matrices (Fleisch, Serum, Urin), bei der die Superkritische Fluidextraktion als auch die Festphasenextraktion sowie die Flüssig/Flüssig-Extraktion als Probenvorbereitung dient, Dünnschichtchromatographie bzw. zweidimensionale Hochleistungsflüssigchromatographie mit UV-Detektion als Screeningmethode und On-line-LC/MS als Konfirmationsmethode zum Einsatz kommen. Die Methode soll in der Folge Kontrollaktivitäten zur Verfügung stehen.
Berichte
Kurzfassung
Steroidale und nichtsteroidale (Stilbene, Resorcylsäurelactone) Hormone sind in Österreich verbotene Masthilfsmittel. Während für Stilbene in der Veterinärmedizin als auch in der Humanmedizin infolge nachgewiesener Cancerogenität ein generelles Anwendungsverbot besteht, ist Zeranol in den USA als Masthilfsmittel (Implantat) offiziell zugelassen. Estrogene werden illegal den Tieren meist subkutan oder intramuskulär appliziert, können aber, weil die Einstichstellen bei der Kontrolle am Schlachthof auffallen können, auch im Mastfutter vorkommen. Als wirksame Dosis ist kleiner 1 mg/kg Körpergewicht anzunehmen. Im fertig abgemischten Futtermittel wird dann um 1 mg/kg oder weniger zu erwarten sein.
Es wurden Extraktionsmethoden aus Futtermittel und Analysenmethoden auf Basis HPLC/MS und HPLC/MSn für folgende Substanzen erarbeitet: Equilenin, Equilin, Estrone, Estradiol, Estriol, Ethinylestradiol, Dienestrol, Diethylstilbestrol, Hexestrol, Zeranol sowie Cyproteron Acetat, Megestrol Acetat, Medroxyprogesteron Acetat, Chlormadinon Acetat, Ethisteron, Norethindron Acetat, Melengestrol Acetat und Ethynodiol Diacetat.
Die Methoden wurden nach internationalen Richtlinien validiert.
Die Problematik der Extraktion von fettlöslichen Substanzen aus einer fettreichen Matrix konnte mit Hilfe einer mehrstufigen Extraktionsmethode zufriedenstellend gelöst werden. Die Ausbeuten lagen bei 67% bis 91% der eingesetzten Menge. Der chromatographische Prozess mit anschließender Detektion im MS/MS-Full-Scan-Modus weist eine hohe Empfindlichkeit (10ppb) sowie eindeutige Spezifität auf. Die gewonnenen Erkenntnisse belegen, dass diese Methode nicht nur zur Anwendung auf Realproben erfolgreich ist, sondern dass auch bei einer weiteren Identifikationsstufe (MSn) die notwendigen Empfindlichkeiten zur eindeutigen Strukturbelegung erreichet werden.
Equilenin, Equilin, Estrone, Estradiol, Estriol, Ethinylestradiol, Dienestrol, Diethylstilbestrol, Hexestrol, Zeranol wurden mittels negativer Elektrosprayionisation, Cyproteron Acetat, Megestrol Acetat, Medroxyprogesteron Acetat, Chlormadinon Acetat, Ethisteron, Norethindron Acetat, Melengestrol Acetat und Ethynodiol Diacetat positiv vermessen.
Die von der Kommission der Europäischen Union (SANCO/1805/2000) empfohlene Identifikationsstufe (MS3) mit der höchsten Punktezahl konnte aufgrund der Zerfallseigenschaften der einzelnen Substanzen nur in wenigen Fällen erreicht werden.
Die in allen Fällen charakteristischen MS2-Spektren sind jedoch so signifikant und in Verbindung mit den chromatographischen Eigenschaften daher als eindeutige Identifikation zu betrachten.
Hinsichtlich der Anwendbarkeit der Methode auf unterschiedliche Matrizes ist ausschließlich deren Fettgehalt von Bedeutung. Bei einem Fettgehalt von über 40% kann diese Methode nicht mehr zuverlässig angewendet werden.