Projekt-106: Entwicklung von Methoden zum qualitativen und quantitativen Nachweis und zur Unterscheidung von Tier- und Fischmehl in Futtermitteln durch Nachweis von DNA mit PCR

Der Nachweis erfolgt durch Amplifizierung spezifischer DNA-Sequenzen mit 2 Methoden der Polymerase-Kettenreaktion (PCR und Real-time-PCR). Dabei wird ein kurzes spezifisches DNA-Stück, die Zielsequenz, exponentiell vermehrt, im ersten Fall in einem Gel sichtbar gemacht, im zweiten Fall entsteht bei der DNA-Synthese ein Fluoreszenzsignal. Der Vorteil dieser Methoden ist die einfache Durchführbarkeit, große Empfindlichkeit und das Potential, eine große Anzahl von Proben untersuchen zu können. Besonders zu betonen ist die Möglichkeit Tier- und Fischmehl zu unterscheiden. Es besteht auch die Möglichkeit einzelne Tierarten (z. B. Rind) spezifisch nachzuweisen. Der Nachweis beruht auf der Tatsache, dass nahe verwandte Arten weniger Unterschiede in der DNA Sequenz aufweisen als entfernter verwandte Arten. Als Zielsequenzen für die PCR wurden Bereiche der DNA gewählt, die innerhalb der relevanten Tiere kaum Unterschiede aufweisen, aber zu Sequenzen aus Fischen und Pflanzen ausreichende Unterschiede zeigen und so eine Unterscheidung erlauben. Das gleiche gilt für die Zielsequenzen zum Nachweis von Fischmehl. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass mit Hilfe der PCR ein Nachweis von Tier- und Fischmehl in Futtermitteln möglich ist. Die untere Nachweisgrenze liegt bei Tiermehl zwischen 0,05% und 0,01% Tiermehl im Futtermittel, bei Fischmehl unter 0,01% Fischmehl im Futtermittel. Damit ist die Methode sensitiver als der mikroskopische Nachweis, der eine Nachweisgrenze von 0,1% hat. Ein weiterer Vorteil liegt in der Möglichkeit, viele Proben parallel zu verarbeiten. Der limitierende Faktor liegt in der Probenvorbereitung (mahlen der Proben), alle weiteren Schritte erlauben ein Verarbeiten von 48 oder 96 Proben. Es kann dann im Mikrotiterplattenformat gearbeitet werden. Für den Nachweis in der Routineanalytik ist besonderst die Real-time-PCR anzuraten. Die Real-time-PCR ist die robustere Methode und sie ist durch die Verwendung einer spezifischen Sonde sicherer. Ein weiterer wichtiger Punkt ist die Verringerung des Kontaminationsrisikos, da die Reaktionsgefäße nach der Reaktion nicht mehr geöffnet werden müssen. Die Real-time-PCR liefert semi-quantitative Ergebnisse und lässt sich in eine quantitative Methode umwandeln, wenn Standardreferenzmaterialien zur Verfügung stehen. Die Methoden sind so weit entwickelt, dass sie von Untersuchungslaboratorien übernommen und nach Validierung zur Untersuchung von Futtermitteln eingesetzt werden können.