Projekt-105: Abbau von TSE erregenden Prionen unter anaeroben Bedingungen; Validierung der Prionen-Analytik in einer unbekannten Faulschlammmatrix und Prionen-Abbauversuche unter anaeroben Bedingungen

In diesem Projekt sollte überprüft werden, ob BSE erregende Prionen in anaerobem Faulschlamm wiederfindbar sind und ob ein Abbau derselben unter anaeroben Bedingungen stattfindet. Das Ergebnis in Kurzform bedeutet, dass eine Wiederfindung von Prionprotein in Faulschlamm möglich ist und in beschränktem Ausmaß ein Abbauverhalten beobachtet werden konnte. Die Arbeiten wurden in Kooperation mit dem Institute for Animal Health, Neuropathogenesis Unit in Edinburgh, in den L2 und L3-Labors der AGES, vet.med. Untersuchungen Mödling durchgeführt. Als Basis für ein Nachweisverfahren von Prionen (in Folge PrP(SC), Prionprotein Scrapie-Form, genannt) wurde der als Testkit erhältliche, für Routinescreening von BSE in Österreich angewandte Prionics-Check Western(R) (Prionics AG, Zürich) gewählt. Dieses auf einer SDSPAGE und Western-Blot beruhende Verfahren musste modifiziert werden, da es in der Testkit-Version nur zum Nachweis von Prionprotein in Stammhirnmatrix geeignet ist. PrPSC in Faulschlamm kann durch eine Spülmittelbehandlung (Lauroylsarcosin 0,5% w/v) unter starkem Schütteln so gut in Lösung gebracht werden, dass eine nachfolgende Zentrifugation alle anderen suspendierten Bestandteile des Faulschlammes in ein Pellet konzentriert und durch eine Dekantierung entfernt werden können. Die Aufkonzentrierung des PrP(SC) aus dem Überstand kann durch eine nachfolgende Tieftemperatur- Ethanolfällung (Mitfällung mit BSA, Fraktion V) durchgeführt werden. Die weiteren Analysenschritte entsprechen im Prinzip dem Prionics-Check Western(R), wenngleich nur die Antikörper aus dem Testkit verwendet wurden. Die Diskriminierung zwischen physiologischem, nicht-pathologischem Prionprotein und der pathologischen Form PrP(SC) erfolgt durch einen Proteinase K-Verdau. Das Hydrolysat wird dann mittels einer SDS-PAGE aufgetrennt, auf eine PVDF-Membran übertragen und fixiert. Die Detektion erfolgt dann durch die Anlagerung eines primären Antikörpers (6H4, Prionics, erkennt eine Prionproteinsequenz) und der Anlagerung eines sekundären enzymgekoppeltenen Antikörpers (gegen den ersten Antikörper), dessen Enzym (alkalische Phosphatase) mit einem geeigneten Substrat eine Lichtreaktion verursacht, die mittels Schwärzung eines sensiblen Röntgenfilms ausgewertet werden kann. Dieses Verfahren liefert jedoch nur einen qualitativen Nachweis auf das Prionprotein PrP(SC). Durch Verdünnungsreihen kann die Bestimmungsgrenze ungefähr erfasst werden. Einige Einflussfaktoren, die die Intensität des Signals beeinflussen, können jedoch nicht standardisiert werden: Antikörper- und Enzymaktivitäten werden von den Herstellern mit einem Unsicherheitsfaktor von ± 40% angegeben; Umgebungstemperaturen, Entwicklerlösungen, etc.. Eine Ermittlung und statistische Absicherung der Bestimmungs- und Nachweisgrenzen wurde nicht durchgeführt, da die ermittelten Werte nur auf die Bedingungen des einen Labors und auf die verwendeten Chemikalienchargen zutreffend gewesen wären. Eine Übertragbarkeit auf andere Laborbedingungen und Schlammarten wäre nicht gegeben. In der hier vorliegenden Arbeit wurde das oben kurz beschriebene Verfahren entwickelt, in den einzelnen Arbeitsschritten auf Alternativen überprüft und optimiert. Die nachfolgenden Validerierungsexperimente konnten in vierfacher Wiederholung beweisen, dass das Prionprotein PrP(SC) aus unterschiedlicher Quelle (Homogenate aus folgenden TSE infizierten Hirnmaterialien: 22A/SV: in Maus passiertes Scrapie; 301V/VM: in Maus passiertes BSE und BSE in Rind) in unterschiedlichen Schlammqualitäten (mesophiler und thermophiler Schlamm bzw. Wasser) mit ausreichender Sicherheit wiedergefunden werden konnte. Ein Vergleich der Nachweisbarkeit von PrPSC in Faulschlamm mit dem Platelia(R) Test von BioRad und dem von Hämosan entwickelten Verfahren bestätigen, dass PrP(SC) in Faulschlamm tatsächlich wiedergefunden werden kann. Die Inkubationsversuche im Kleinstmaßstab führten zum Schluss, dass ein Abbau von TSE erregenden Prionen in höherer Umsatzrate nur unter thermophilen Bedingungen (55°C) stattfinden wird. Unter mesophilen Bedingungen (35°C) konnte innerhalb einer Inkubationsdauer von 380 Stunden im Gegensatz zu thermophiler Temperatur kein Abbau nachvollzogen werden. In dampfsterilisiertem und mit Natriumazid inhibiertem Faulschlamm konnte im Gegensatz zur Inkubation mit Wasser und aktivem Faulschlamm nach sehr kurzer Zeit kein PrP(SC) mehr nachgewiesen werden. Die Gründe für dieses unerwartete Resultat konnten im Rahmen dieses Projektes nicht verifiziert werden.