Krebspest: Untersuchung autochthoner und allochthoner Krebsarten heimischer Gewässer auf Pilzinfektionen, unter besonderer Berücksichtigung von Aphanomyces astaci, und Klassifizierung des Erregers mittels moderner molekularbiologischer Methoden
Projektleitung
Elisabeth Licek
Forschungseinrichtung
Veterinärmedizinische Universität Wien - Klinisches Department für Nutztiere und Bestandsbetreuung - Klinik für Geflügel, Ziervögel, Reptilien und Fische
Projektnummer
1362Projektlaufzeit
-
Finanzierungspartner
Bundesministerium für Land- und Forstwirtschaft, Umwelt und Wasserwirtschaft
Allgemeine Projektinformationen
Projektziele
1. Untersuchung klinisch erkrankter Krebse auf den Erreger Aphanomcyes astaci sowie Determinierung von anderen pathogenen Pilzarten.
2. Untersuchung allochthoner (nicht heimischer) Krebsarten auf den Erreger Aphanomyces astaci.
3. Isolation von Pilzen, Charakterisierung der Arten durch PCR und (gegebenenfalls) Sequenzierung. (Aphanomyces astaci oder andere Erreger?)
4. Etablierung einer sensitiven und spezifischen Methode (Multiplex-PCR) zur Abschätzung des österreichweiten Erreger-Verbreitungspotentials und anderer pathogener Pilzarten mit dem Ziel einer konsequenten, risikofreien Wiedereinbürgerung heimischer Krebsarten.
5. Korrelation der Ergebnisse mit limnologisch relevanten Parametern für eine Krebspest-Risikoabschätzung.
6. Erarbeitung eines Bekämpfungsprogramms gegen die Krebspest.
Probenmaterial: Für die Untersuchung werden sowohl symptomlose, eingebürgerte Krebsarten, als auch offensichtlich kranke und vor kurzem verendete Tiere gesammelt und untersucht. Zur Abklärung anderer Ursachen (Wasserchemie) für ein Krebssterben soll den Proben eine Wasserprobe (5 l) und ein eigens dafür entworfenes, nach Möglichkeit vollständig ausgefülltes, Anamneseblatt (Vorbericht), beigelegt werden. Das Anamneseblatt umfasst zusätzliche limnologische und klimatische Angaben, die von Laien ohne Messgeräte einfach durchgeführt werden können.
2. Untersuchung allochthoner (nicht heimischer) Krebsarten auf den Erreger Aphanomyces astaci.
3. Isolation von Pilzen, Charakterisierung der Arten durch PCR und (gegebenenfalls) Sequenzierung. (Aphanomyces astaci oder andere Erreger?)
4. Etablierung einer sensitiven und spezifischen Methode (Multiplex-PCR) zur Abschätzung des österreichweiten Erreger-Verbreitungspotentials und anderer pathogener Pilzarten mit dem Ziel einer konsequenten, risikofreien Wiedereinbürgerung heimischer Krebsarten.
5. Korrelation der Ergebnisse mit limnologisch relevanten Parametern für eine Krebspest-Risikoabschätzung.
6. Erarbeitung eines Bekämpfungsprogramms gegen die Krebspest.
Probenmaterial: Für die Untersuchung werden sowohl symptomlose, eingebürgerte Krebsarten, als auch offensichtlich kranke und vor kurzem verendete Tiere gesammelt und untersucht. Zur Abklärung anderer Ursachen (Wasserchemie) für ein Krebssterben soll den Proben eine Wasserprobe (5 l) und ein eigens dafür entworfenes, nach Möglichkeit vollständig ausgefülltes, Anamneseblatt (Vorbericht), beigelegt werden. Das Anamneseblatt umfasst zusätzliche limnologische und klimatische Angaben, die von Laien ohne Messgeräte einfach durchgeführt werden können.
Praxisrelevanz
Die für die Krebspest kennzeichnende hohe Infektionsrate und nahezu 100 %ige Mortalität, welche in der Veterinärmedizin epidemiologisch einzigartig sind, führen auch heute noch, 142 Jahre nach erstmaligem Auftreten, zu Massensterben in natürlichen und in wirtschaftlich genutzten Gewässern.
Das Fehlen eines etablierten diagnostischen Nachweisverfahrens in Österreich führt zu folgenden Problemen:
- Durch Aphanomyces astaci hervorgerufene wirtschaftlich relevante Ausfälle in Österreich lassen sich, aufgrund fehlender nationaler Nachweisverfahren, schwer schätzen. Treten jedoch Totalausfälle in Zuchtanstalten und Teichwirtschaften auf, treffen sie den Bewirtschafter, bei Marktpreisen von 36-62 Euro pro Kilogramm Edelkrebs (Solokrebs II und Solokrebs I) und einer durchschnittlichen Produktivität von 10-50 kg pro Hektar, empfindlich (Hager J., 1996).
- Weiters kann die von den diversen Landesfischereigesetzen geforderte 'seuchenhygienische Unbedenklichkeit' bei Satzkrebsen derzeit nicht erbracht werden. Da nach jüngsten wissenschaftlichen Untersuchungen auch krebsfressende Fische als Überträger der Krebspest in Frage kommen, ist es sinnvoll auch Satzfische, die Kontakt zu Krebsen gehabt haben, in die Untersuchung mit einzubeziehen.
- Alle heimischen Krebsarten sind in der österreichischen Roten Liste als 'vom Aussterben bedroht' eingestuft. Da sie außerdem in der Liste der FFH- Richtlinie (92/43/EWG) 'Natura 2000' angeführt sind, erscheint es sinnvoll, gemäß Artikel 12 und 13 der Tierseuchenvorschrift Aquakultur RL 91/67 EWG ('Fischseuchenrichtlinie'), in dessen Anhang A die Krebspest in der Liste 3 zu finden ist, ein Bekämpfungsprogramm zusammenzustellen (EWG - Tierseuchenvorschrift Aquakultur, 1991). Dieses Seuchenschutzprogramm wird in einer anschließenden Prüfung durch eine Kommission genehmigt Ist ein Mitgliedsstaat der Auffassung, dass sein gesamtes Territorium oder Teile davon frei von dieser Krankheit sind, so werden diese Angaben wiederum durch die Kommission überprüft. Danach kann für das Verbringen von betroffenen Tieren (also in diesem Fall von Krebstieren) in solche Gebiete eine Garantie hinsichtlich Seuchenfreiheit verlangt und diese auch überprüft werden. Ein diagnostisches Verfahren, das Überblick über die nationale Verbreitung des Erregers liefert, ist in diesem Fall unumgänglich (Heistinger H., 2001).
- Das Fehlen eines etablierten Nachweisverfahrens in Österreich erschwert auch die Ahndung der absichtlichen und fahrlässigen Verbreitung durch den Menschen gemäß §182 und §183 des Strafgesetzbuches (Heistinger H., 2001).
Zentrale Schwerpunkte und Fragestellungen der Untersuchung
1. Untersuchung klinisch erkrankter Krebse auf den Erreger Aphanomcyes astaci sowie Determinierung von anderen pathogenen Pilzarten
2. Untersuchung allochthoner (nicht heimischer) Krebsarten auf den Erreger Aphanomyces astaci
3. Isolation von Pilzen, Charakterisierung der Arten durch PCR und (gegebenenfalls) Sequenzierung. (Aphanomyces astaci oder andere Erreger?)
4. Etablierung einer sensitiven und spezifischen Methode (Multiplex-PCR) zur Abschätzung des österreichweiten Erreger-Verbreitungspotentials und anderer pathogener Pilzarten mit dem Ziel einer konsequenten, risikofreien Wiedereinbürgerung heimischer Krebsarten.
5. Korrelation der Ergebnisse mit limnologisch relevanten Parametern für eine Krebspest-Risikoabschätzung
Das Fehlen eines etablierten diagnostischen Nachweisverfahrens in Österreich führt zu folgenden Problemen:
- Durch Aphanomyces astaci hervorgerufene wirtschaftlich relevante Ausfälle in Österreich lassen sich, aufgrund fehlender nationaler Nachweisverfahren, schwer schätzen. Treten jedoch Totalausfälle in Zuchtanstalten und Teichwirtschaften auf, treffen sie den Bewirtschafter, bei Marktpreisen von 36-62 Euro pro Kilogramm Edelkrebs (Solokrebs II und Solokrebs I) und einer durchschnittlichen Produktivität von 10-50 kg pro Hektar, empfindlich (Hager J., 1996).
- Weiters kann die von den diversen Landesfischereigesetzen geforderte 'seuchenhygienische Unbedenklichkeit' bei Satzkrebsen derzeit nicht erbracht werden. Da nach jüngsten wissenschaftlichen Untersuchungen auch krebsfressende Fische als Überträger der Krebspest in Frage kommen, ist es sinnvoll auch Satzfische, die Kontakt zu Krebsen gehabt haben, in die Untersuchung mit einzubeziehen.
- Alle heimischen Krebsarten sind in der österreichischen Roten Liste als 'vom Aussterben bedroht' eingestuft. Da sie außerdem in der Liste der FFH- Richtlinie (92/43/EWG) 'Natura 2000' angeführt sind, erscheint es sinnvoll, gemäß Artikel 12 und 13 der Tierseuchenvorschrift Aquakultur RL 91/67 EWG ('Fischseuchenrichtlinie'), in dessen Anhang A die Krebspest in der Liste 3 zu finden ist, ein Bekämpfungsprogramm zusammenzustellen (EWG - Tierseuchenvorschrift Aquakultur, 1991). Dieses Seuchenschutzprogramm wird in einer anschließenden Prüfung durch eine Kommission genehmigt Ist ein Mitgliedsstaat der Auffassung, dass sein gesamtes Territorium oder Teile davon frei von dieser Krankheit sind, so werden diese Angaben wiederum durch die Kommission überprüft. Danach kann für das Verbringen von betroffenen Tieren (also in diesem Fall von Krebstieren) in solche Gebiete eine Garantie hinsichtlich Seuchenfreiheit verlangt und diese auch überprüft werden. Ein diagnostisches Verfahren, das Überblick über die nationale Verbreitung des Erregers liefert, ist in diesem Fall unumgänglich (Heistinger H., 2001).
- Das Fehlen eines etablierten Nachweisverfahrens in Österreich erschwert auch die Ahndung der absichtlichen und fahrlässigen Verbreitung durch den Menschen gemäß §182 und §183 des Strafgesetzbuches (Heistinger H., 2001).
Zentrale Schwerpunkte und Fragestellungen der Untersuchung
1. Untersuchung klinisch erkrankter Krebse auf den Erreger Aphanomcyes astaci sowie Determinierung von anderen pathogenen Pilzarten
2. Untersuchung allochthoner (nicht heimischer) Krebsarten auf den Erreger Aphanomyces astaci
3. Isolation von Pilzen, Charakterisierung der Arten durch PCR und (gegebenenfalls) Sequenzierung. (Aphanomyces astaci oder andere Erreger?)
4. Etablierung einer sensitiven und spezifischen Methode (Multiplex-PCR) zur Abschätzung des österreichweiten Erreger-Verbreitungspotentials und anderer pathogener Pilzarten mit dem Ziel einer konsequenten, risikofreien Wiedereinbürgerung heimischer Krebsarten.
5. Korrelation der Ergebnisse mit limnologisch relevanten Parametern für eine Krebspest-Risikoabschätzung
Berichte
Kurzfassung
Im vorliegenden Forschungsprojekt ist es gelungen, aus symptomlosen burgenländischen Signalkrebsen den Krebspesterreger A.astaci zu isolieren und molekularbiologisch zu definieren. In weiteren Studien wurde erstmals eine vollständig beschriebene Glykosyl-Hydrolase Familie 18, Klasse V - Chitinase des Oomyceten A.astaci (Gb04) mit Hilfe der 5`, 3`-RACE-PCR (rapid amplification of cDNA ends-PCR) aus der Gesamt-RNA isoliert und analysiert.
Aufgrund der für das Krankheitsgeschehen 'Krebspest' unverzichtbaren Funktion der Chitinase wurde dieses Gen als zentraler Schwerpunkt für die molekularbiologische Diagnostik herangezogen. In einem qPCR-Assay wurde auf Grundlage der Chitinase ein A. astaci - spezifisches Primerset mit Oligonukleotiden aus der ITS-Region in einer Duplex-Reaktion kombiniert und evaluiert. Mit Hilfe dieses Tests konnte der Erreger zweifelsfrei in Freilandproben aus verschiedenen Bundesländern, wie z.B: Salzburg, Kärnten und dem Burgenland, detektiert werden.
Auf Protein-Ebene wurde basierend auf einem Strukturmodell der katalytischen Domäne der Chitinase spezifisch gerichtete Antikörper produziert. Eingesetzt im Westernblot konnte das Enzym extrazellulär detektiert werden.
Weiters gelang die Isolierung und Charakterisierung zweier als N-Acetylhexosaminidasen fungierender extrazellulärer, chitinolytischer Enzyme von A. astaci. Sie sind hauptverantwortlich für die substratunabhängige, konstitutive chitinolytische Aktivität, welche auch als diagnostisches Kriterium für A. astaci herangezogen wird.
Das extrazelluläre chitinolytische Enzymsystem von A. astaci kann somit wie folgt beschrieben werden:
Chitinase dient zur Aufspaltung von Chitin in Dimere von N-Acetylglucosamin, während die endgültige Aufspaltung in Monomere durch die N-Acetylhexosaminidasen erfolgt.