TiNo Austria: Optimierung der Tiefgefrierkonservierung von Samen für Norikerpferde in Österreich mit dem Ziel der Anlage einer Tiefgefriersamenbank

In dem Forschungsprojekt wird der Frage nachgegangen, wie durch Vorauswahl der Hengste, Modifikationen der Samenaufbereitung und neue Systeme des Sameneinsatzes und Samenversandes der Einsatz von Tiefgefrier-(TG)-Samen in der landwirtschaftlichen Pferdezucht des Norikers deutlich verbessert werden kann. Damit werden Akzeptanz und Erfolg eines solchen Besamungsprogramms in der Erhaltungszucht dieser österreichischen Pferderasse verbessert. Ziel des Projektes ist es, die technischen Voraussetzungen für die Anlage und Verwendung einer Samenbank für Norikerhengste soweit zu verbessern, dass Tiefgefriersamen langfristig in der Erhaltungszucht des Noriker Pferdes verwendet werden kann. Um dieses übergeordnete Ziel zu erreichen, werden in fünf Tielprojekten (TP) die folgenden Unterziele verfolgt und Hypothesen geprüft

Teilprojekt 1: Auswirkung einer Langzeit-Tiefgefrierlagerung auf die Samenqualität

Ziel: Analyse, ob eine Langzeit-TG-Lagerung zu einer Verschlechterung der Samenqualität führt.

Hypothese: Bei langfristiger TG-Lagerung kommt es zu einer Abnahme der Samenqualität, insbesondere der DNA-Integrität, und der Befruchtungsfähigkeit.

Hintergrund: Beim Rind ist die als non-return Rate erfasste Trächtigkeitswahrscheinlichkeit bereits nach einer TG-Samenlagerung von 5 bis 6 Jahren gegenüber nur kurzfristig gelagertem TG-Samen um bis zu 2,5% reduziert (Lundgren 1980, Haugan et al. 2008). Für das Pferd liegen dazu bisher keine publizierten Ergebnisse vor. Vorläufige eigene Untersuchungen deuten aber darauf hin, dass Hengstsamen, der vor 10 bis 20 Jahren eingefroren wurde, heute eine schlechtere Motilität nach dem Auftauen aufweist als Samenportionen der gleichen Ejakulate, die kurz nach dem Einfrieren aufgetaut wurden (Bernardi und Aurich, unveröffentlicht).

Teilprojekt 2: Bedeutung von Spermien-RNA als Biomarker für die Fertilität von TG-Samen

Ziel: Vorhersage einer Eignung von Hengsten für die Samentiefgefrierkonservierung anhand von spezifischen RNA-Sequenzen in den Spermien als Biomarker

Hypothese: Das Vorkommen der RNA spezifischer, für die Spermienfunktion relevanter Gene unterscheidet sich zwischen Hengsten mit guter und schlechter Tiefgefriereignung ihres Samens und erlaubt daher eine Selektion von Hengsten für die Kryokonservierung ihres Samens.

Hintergrund: Eine gute Qualität des Nativ- und TG-Samens bedingt nicht immer auch eine gute Fruchtbarkeit von TG-Samen dieser Hengste. Bei der Befruchtung überträgt das Spermium nicht nur sein Genom, sondern auch ein Spektrum an RNA und Proteinen auf die Eizelle. Die Spermien-RNA enthält spezifische RNA-Transkripte, die regulatorische Effekte bei der Befruchtung und frühen Embryonalentwicklung haben und Informationen vom Vater auf die Nachkommen übertragen können (Burl et al. 2018, Bohacek und Rassoulzadegan 2020). Veränderungen der Spermien-RNA durch die TG-Konservierung verändern diese mit großer Wahrscheinlichkeit auch funktionell. In einer eigenen Studie konnten bereits einzelne Gene als mögliche Biomarker für die Diagnose einer reduzierten Fruchtbarkeit von TG-Samen bei Hengsten identifiziert werden (Vigolo et al. 2024).

Teilprojekt 3: Auswahl von Norikerhengsten für die Samen-TG-Konservierung und Verbesserung der Einfriermethoden

Ziel: Auswahl von Hengsten für die Herstellung von TG-Samen und Verbesserung der Einfriermethoden unter Berücksichtigung Noriker-spezifischer Samencharakteristika

Hypothese: Die Konzentration des vorverdünnten Samens mittels eines Spermienfilters führt im Vergleich zur Standardmethode der Zentrifugation des Samens zu einer maximalen Spermienausbeute bei minimaler Spermienschädigung.

Hintergrund: Die Kryokonservierung von Hengstsamen erfordert die weitgehende Entfernung des Seminalplasmas. Dies erfolgt üblicherweise durch Zentrifugation. Ejakulate von Norikern zeichnen sich durch große Volumina bei geringer Samenkonzentration aus (Aurich et al. 1998; Aurich et al. 2003). Die Verwendung einer üblichen Zentrifugalkraft (600g) führt bei Ejakulaten mit niedriger Konzentration zu einem großen Spermienverlust im Überstand. Eine Erhöhung der Zentrifugalkraft verbessert zwar die Ausbeute, schädigt aber die Spermien (Bradecamp 2021). Für die Tiefgefrierung von Norikersamen soll daher im Vergleich zur Zentrifugation die Alternativmethode einer Filtration des Samens (Ramires-Neto et al. 2013) geprüft und angepasst werden.

Teilprojekt 4: TG-Samenaufbereitung für einen vereinfachten Besamungseinsatz in der Norikerzucht

Ziel: Kurzzeitlagerung und Verwendung von aufgetautem TG-Samen als Kühlsamen

Hypothese: Unter Verwendung neuer Samenverdünner und veränderten Lagertemperaturen behält aufgetauter TG-Samen über zwei Tage eine für den Besamungseinsatz geeignete Samenqualität und kann mit guten Trächtigkeitsergebnissen in der landwirtschaftlichen Norikerzucht eingesetzt werden.

Hintergrund: Auf der Stutenseite erfordert die traditionelle Besamung mit TG-Samen nahe am Ovulationszeitpunkt ein aufwändiges Management mit häufigen Follikelkontrollen. Die Akzeptanz einer TG-Besamung bei Kaltblutpferden ist daher eher gering. Vor kurzem wurde die Möglichkeit, TG-Samen von Hengsten nach dem Auftauen wie Kühlsamen aufzubereiten und zu verwenden, an einer kleinen Anzahl von Stuten geprüft (Prell et al. 2020). Die Möglichkeit, TG-Samen auf einer zentralen Station aufzutauen und dann als Kühlsamen in Zuchtbetrieben einzusetzen, ist für die Norikerzucht von besonderem Interesse.

Der Noriker ist ein traditionelles österreichisches Gebirgskaltblutpferd, das seit dem 16. Jahrhundert vor allem in Salzburg gezüchtet wird. Der Landespferdezuchtverband Salzburg führt für diese Rasse das Ursprungszuchtbuch. Mit einem Bestand von etwa 4500 Stuten und weniger als 200 Hengsten gehört der Noriker zu den in ihrem Bestand gefährdeten Pferderassen. Bei solchen Pferderassen ist die Anlage von Genreserven mittels Samenbanken empfehlenswert. Kommt es zu einer weiteren Verringerung des Hengstbestandes oder fallen z.B. nach Identifikation von bislang unbekannten Gende-fekten Anlage- bzw. Merkmalsträger als Zuchthengste aus, kann die TG-Samenreserve dazu verwendet werden, den Hengstpool zu erweitern.

Auf der Stutenseite erfordert die Besamung mit TG-Samen im Vergleich zur Besamung mit Kühlsamen oder zur Belegung im sogenannten Natursprung ein deutlich aufwändigeres Management. Die Überlebensfähigkeit des aufgetauten Samens im Geschlechtstrakt der Stute ist mit etwa 12 Stunden im Vergleich zu mindestens 36 Stunden bei Frisch- oder Kühlsamen deutlich reduziert. Daher muss die Besamung dicht am Eisprung erfolgen. Dies erfordert häufige tierärztliche Follikelkontrollen bei den Stuten. Die Akzeptanz einer Besamung mit Tiefgefriersamen ist aufgrund der hohen Kosten bei Kaltblutpferden derzeit eher gering.

In dem gemeinsam vom Zentrum für Reproduktion der Vetmeduni Wien und dem Landespferdezuchtverband Salzburg geplanten Forschungsvorhaben werden die Voraussetzungen für ein an die Strukturen und finanziellen Voraussetzungen der Norikerzucht angepasstes Besamungsprogramm, den Aufbau einer Samenbank als Genreserve und die aktive Nutzung dieser Samenbank als Teil des Erhaltungszuchtprogramms geschaffen. Die Umsetzung des Besamungsprogramms in Salzburg wird im Rahmen des Projektes wissenschaftlich begleitet.

Der Aufbau einer Samenbank für Noriker ist nach Ende des Projektes unter Beteiligung der relevanten Institutionen zu diskutieren. Dazu gehören zumindest der Landespferdezuchtverband Salzburg als Ursprungszuchtbuch Noriker, die HBLFA Raumberg-Gumpenstein (Thalheim), die Zentrale Arbeitsgemeinschaft Österreichischer Pferdezüchter (Pferd Austria) und die Vetmeduni Wien. Dabei ist auch der Standort der Samenbank (oder mehrere Standorte) festzulegen. Eine Ausdehnung auf andere Landeszuchtverbände und Pferderassen (e.g., Haflinger, Lipizzaner) ist denkbar.