Projekt-23: Biodiversität österreichischer Fusarium spp. und Möglichkeiten zu deren spezifischem genotypischen Nachweis in Pflanzen- und Bodenproben

Fusarien zählen zu den wichtigsten pflanzenpathogenen Pilzen weltweit und verursachen jährlich nicht unbeträchtliche Ernteeinbußen bei Kulturpflanzen wie z.B. Getreide, Mais, Reis, Zuckerrohr, Hirse, Baumwolle, Datteln, Leguminosen und Kartoffeln. In Österreich liegt die Hauptschadwirkung bei Mais und verschiedenen Getreidesorten - aber auch Leguminosen, Kartoffel und einige Zierpflanzen sind oft massiv betroffen. Der gravierendste Schaden entsteht bei Befall von Pflanzenmaterial durch Fusarien nicht durch eine Ertragsminderung sondern durch eine oft starke Kontamination der Ernte mit Fusarium Toxinen. Diese Toxine werden häufig nur von bestimmten Spezies oder klonalen Populationen gebildet und daher lässt sich durch eine genaue Bestimmung der Art oftmals eine Vorhersage des zu erwartenden Mykotoxinspektrums treffen. Auf morphologischem Weg ist dies sowohl ein zeitraubendes als auch manchmal fehlerbehaftetes Unterfangen, da einerseits ein Kultivierungsschritt notwendig ist und andererseits die so angezüchteten Stämme oft sehr rasch degenerieren. Im Rahmen einer umfangreichen Studie, durchgeführt am United States Department of Agriculture in Peoria, USA, gelang es erstmals durch die Einbeziehung von unkonventionellen Gensequenzen eine verlässliche Unterscheidung einiger Spezieskomplexe von Fusarium auf molekulartaxonomischer Ebene zu entwickeln. Ziel der durchgeführten Untersuchung war es, aufbauend auf diesen Daten, zuverlässige, einfache und sensitive Untersuchungsmethoden zu entwickeln, die die Möglichkeit bieten, die in Österreich häufigen Fusarium Arten (F. avenateum, F. cerealis, F. culmorum, F. equiseti, F. graminearum, F. oxysporum, F. poae, F. proliferatum, F. sambucinum, F. solani, F. sporotrichioides, F. subglutinans und F. tricinctum) zu identifizieren und deren Nachweis sowohl direkt in der Wirtspflanze wie auch in Bodenproben zu ermöglichen. Zu diesem Zweck wurden in diesem Projekt, aufbauend auf einer dafür angelegten Sequenzdatenbank, zwei molekulartaxonomischen Schnellnachweismethoden etabliert und deren Leistungsfähigkeit anhand ausgewählter Beispiele evaluiert. Weiters wurden die ursprünglich mit reiner Fusarium-DNA durchgeführten Methoden in einem Hintergrund von Pflanzen- bzw. Pilz-DNA getestet um sie auf deren Anwendbarkeit bei verschiedensten biologischen Proben zu überprüfen. Alle im Zuge des Projekts erhaltenen Ergebnisse heben beide Methoden als vielversprechende Alternativen zur bisherigen morphologischen Bestimmung mit großem Potential für einen Einsatz in einer kultivierungsunabhängigen Routineanalytik hervor. Wie bereits erwähnt wurde in diesem Projekt eine österreichweite Sequenzdatenbank der am häufigsten vorkommenden Fusarium Spezies angelegt. Diese Datenbank wurde, um ihre Repräsentanz zu erhöhen, um eine Sammlung von mehr als 100 europäischen Isolaten erweitert. Aus den so erarbeitenden Daten wurde die notwendige Information für die Entwicklung von kultivierungsunabhängigen, schnellen und einfach handhabbaren molekularbiologische Methoden zum Nachweis der unterschiedlichen Fusarium Spezies herausgefiltert. Zwei Methoden (Dentaturierende Gradienten Gel Elektrophorese [DGGE], bzw. Amplification Refractory Mutation System [ARMS]), beruhend auf der Polymerase Kettenreaktion (PCR), wurden etabliert und an ausgewählten Beispielen evaluiert. In beiden Fällen konnten die gewünschten Vorgaben erreicht und damit zufrieden stellende Ergebnisse erzielt werden. Besondere Beachtung sollte dabei sowohl die rasche Durchführbarkeit als auch die hohe Sensitivität der Analyseverfahren, welche die Grundlage für die Entwicklung von 'high through put' Routineverfahren bieten sollten, finden. Deutlich konnte eine Anwendung nicht nur für Reinkulturen sondern auch für Mischproben (Mehrfachbestimmungen in einer Reaktion, keine Störeffekte durch Pflanzen- oder andere Pilz-DNA) gezeigt werden, was diese Methodiken den meisten anderen überlegen macht. Letztlich wurde die Anwendung der präsentierten Analyseverfahren auf Proben aus Pflanzenmaterial bzw. Bodenproben getestet und optimiert. Die entwickelten Methoden sind ein brauchbares molekulares Werkzeug, um einige der wichtigsten pflanzenpathogenen Pilze Österreichs rasch und sicher identifizieren zu können. Die präsentierten Resultate stellen aber auch eine Grundlage für die Entwicklung eines Detektionssystems der 'biologischen Aktivität' dieser Pilze in ihren jeweiligen natürlichen Substraten (Wirtspflanzen, Boden) dar. Basierend auf den in diesem Projekt etablierten Methoden könnte durch eine direkte Quantifizierung der mRNA mittels reverser Transkription und 'real time'-PCR Analyse eine Bestimmung des Wachstums der jeweiligen Fusarium Spezies in den zu untersuchenden Proben vorgenommen werden. Bezieht man bei einer derartigen, noch zu entwickelnden Untersuchungsmethode Transkripte von Genen, die für Proteine kodieren welche an der jeweiligen Toxinsynthese beteiligt sind, in die Analyse mit ein, wäre eine rasche Risikoabschätzung von sich erst auf den jeweiligen Wirten entwickelnden oder latent im Boden vorkommenden Fusarien-Populationen möglich.