Permanentschimmelung/roan beim Pferd

© Druml, T, E. Schroll

FARBgen 2

Allgemeine Projektinformationen

Titel (deutsch)

Untersuchungen zur genetischen Tiergesundheit und Farbgenetik beim Lipizzaner und Noriker mit Fokus auf Melanom, Vitiligo und Roan

Titel (englisch)

Genetic analyses of coat color related loci with respect to animal health status

Abstract (englisch)

Genetic disorders negatively influence animal welfare, performance status of animals and simultaneous have negative financial impact for the breeders. Especially coat color, which on the one hand represents central breeding objective in Lipizzan and Noriker horses, is on the other hand often related to diseases, which is the case for melanoma and vitiligo in Lipizzans. Both disorders have been intensively investigated, but the molecular genetic background is still unknown. In previous works, the proposer was able to show by means of genome-wide selection signature studies, that several tumor suppressor genes (SPRY4, HSP90AB1, NDFIP1 and IMPDH2) are involved in melanoma pathogenesis in Lipizzan horses. For vitiligo, a disorder which results in successively loss of pigment on the muzzles, around the eyes and the perianal region, up to date no loci were associated with this kind of phenotype in horses. In this project we aim to identify candidate regions and genetic markers associated with melanoma and vitiligo in Lipizzan horses by means of genome-wide association analyses.
Roan coat color is part of the main breeding objectives in Noriker horses and has an economic impact for the breeders. In previous works we identified a genetic marker on ECA3 associated with roan coat color and detected a roan specific haplotype that segregates in the breeds Noriker, Quarter Horse, Murgese and Slovenian Coldblood. Nevertheless, the causative mutation is still unknown. One aim of this project is gain a further insight in the genetic background of roan coat color by means of sequence analyses of a longer stretch around the KIT region on ECA3.
Summarizing the objectives of this project, we aim to identify genetic markers, which can be used for genomic selection against Melanoma and Vitiligo in Lipizzan horses and to optimize the breeding of roan Noriker, which can be helpful to increase the gene pool of roan Noriker horses.

Schlagwörter (deutsch)

Pferdezucht, Lipizzaner, Noriker, Farbgene, Vitiligo, Melanom, SNP Analysen, Molekulargenetik

Projektleitung

Thomas Druml

Forschungseinrichtung

Veterinärmedizinische Universität Wien

Finanzierungspartner

Bundesministerium für Landwirtschaft, Regionen und Tourismus

Projektnummer

101483

Projektlaufzeit

-

Projektziele

Dieser Projektantrag beinhaltet genetische Analysen in Bezug auf die Förderung der Tiergesundheit beim Pferd, insbesondere beim Lipizzaner, und die Identifizierung von genetischen Faktoren die Melanom und Vitiligo hervorrufen und eine genauere Charakterisierung der KIT Region in Hinblick auf den Roan Locus. Das Ziel des Projekts ist es 1. Phänotyp Daten für Melanom und Vitiligo zu erheben, zu klassifizieren und statistisch auszuwerten und Umwelteffekte zu bestimmen, 2. eine genomweite Assoziationsanalyse mit den Phänotyp Daten durchzuführen, um spezifische Marker bzw. putative Kandidatengenregionen zu bestimmen und 3. den beim Noriker verifizierten und mit der Mohrenkopffarbe assoziierten SNP bei weiteren Rassen zu bestätigen und mittels vergleichender Sequenzanalysen weitere populationsspezifische Marker bzw. die kausative Mutation zu identifizieren.

1. Prävalenz und genetischer Hintergrund von Melanomen und Vitiligo beim Lipizzaner
Erkrankungen der Haut, wie das Melanom oder die Weißfleckenkrankheit (Vitiligo), wurden beim Lipizzaner intensiv untersucht und es konnte eine Beziehung zum Allelstatus am STX17 Gen, welches sich für die Schimmelfarbe beim Pferd verantwortlich zeigt, nachgewiesen werden (Pielberg et al., 2008; Curik et al., 2013). Der Genotyp am Grau-Locus ist besonders bei Pferderassen mit hoher Prävalenz für das Melanom bedeutsam, das bei reinerbigen Schimmeln verstärkt auftritt (Pielberg et al., 2008). Ebenfalls gehäuft tritt bei homozygoten Lipizzaner Schimmeln Vitiligo auf, eine mit dem Alter fortschreitende Depigmentierung der Haut, die vor allem im Kopf und Anal- und Geschlechtsbereich zu sehen ist. Die zugrundeliegende genetische Ursache konnte noch nicht identifiziert werden, es wird vermutet, dass es sich um einen Einzelgeneffekt handelt, der eventuell mit dem Grau-Gen gekoppelt ist. Die Häufigkeit von Melanomen liegt bei Lipizzanern über 15 Jahren bei 80% (Seltenhammer et al., 2003; Curik et al., 2013). Da beim Schimmel vor allem gutartige Tumore vorherrschen (Seltenhammer et al., 2004), geht man davon aus, bzw. zeigen genomweite Signaturstudien, dass mehrere Suppressor Gene an der Erkrankung beteiligt sind (Grilz-Seger et al. 2019). In Bezug auf Vitiligo, eine Pigmentstörung, die beim Lipizzaner ab dem mittleren Alter sichtbar wird, liegen Varianzkomponentenschätzungen vor, aber es konnten bislang keine Loci mit dieser Krankheit beim Pferd assoziiert werden. Durch eine Assoziation von Phänotypdaten mit Genotypdaten wäre es erstmals möglich, potentielle genetische Marker beim Lipizzaner zu identifizieren. Die dafür notwendigen SNP Daten liegen aus den Vorprojekten bereits vor, die Phänotyp Daten müssten vor Ort erhoben werden. Im Zuge der wissenschaftlichen Auseinandersetzung mit dem STX17 Gen eröffneten sich weitere Fragestellungen, deren vertiefende Erforschung Erkenntnisse von wichtiger wissenschaftlicher und praktischer Relevanz erwarten lassen. Es gibt Hinweise für einen Zusammenhang zwischen der Fuchsfarbe (MC1R), der Schimmelfarbe (STX17) und dem UVSSA Gen beim Pferd (Grilz-Seger et al., 2019a; Grilz-Seger et al., 2019d). UVSSA spielt eine wichtige Rolle im Reparaturmechanismus von UV induzierten DNA Schäden (Higa et. al, 2016). Unterschiede in der Melanin Produktion haben weitreichende Auswirkungen auf die Schutzwirkung gegen UV-Strahlung und dieser Gegenstand ist ein wichtiger Forschungsschwerpunkt der Humangenetik, der beim Pferd noch nicht hinreichend untersucht wurde. Die vorhandenen SNP Daten ermöglichen eine weiterführende Untersuchungen über den Zusammenhanges zwischen dem Allel Status der STX17 Mutation und den UVSSA Gen.

2. Das MC1R Gen steht durch seine Bedeutung in der Pigmentsynthese im Mittelpunkt der Farbgenetischen Forschung bei Mensch und Tier (Garcia-Borron et al., 2015). Es wurden mehrere Haplotypen festgestellt, die als Selektionssignaturen interpretiert werden. Bislang ist eine genauere Charakterisierung dieser Haplotypen beim Pferd noch ausständig. Reissmann et al. konnte eine zweite MC1R Allel-Variante identifizieren, die hohe phänotypische Variabilität kann durch die beiden bekannten Fuchs-Allele noch nicht erklärt werden.

3.Identifizierung der gentischen Grundlagen der Mohrenkopffarbe
Der genetische Hintergrund der beim Noriker gezüchteten Fellfarben (Braun, Fuchs, Rappe, Mohrenkopf, Schecke, Tiger) ist bis auf Ausnahme der Mohrenkopf Färbung (engl. blue roan) bekannt. Marklund et al. haben 1999 gezeigt, dass der roan Faktor auf dem equinen Chromosom 3 in die Nähe der KIT Region lokalisiert ist. Gleichzeitig wurde von Forschergruppen (Hintz and VanVleck, 1979; Marklund et al., 1999) postuliert, dass Homozygotie am roan Locus zur Frühresorption des Embryos führt. Diese Hypothese wurde jedoch in weiterer Folge in Frage gestellt (Sponenberg und Bellone, 2009), es ist aber bislang noch nicht gelungen, die kausale Mutation für diese für den Noriker typische Fellfärbung zu finden. Im Rahmen des BMNT Projektes FARBgen 101332 konnte von der Antragstellerin ein mit der Mohrenkopffarbe beim Noriker assoziierter SNP auf Chromosom 3 identifiziert werden Grilz-Seger et al. (2019). In weiterer Folge gelang die Verifizierung des mit der Mohrenkopffarbe assoziierten SNP beim Noriker, dieser genetische Marker kann nun als genetischer Marker beim Noriker genutzt werden. Mit den in einer weiterführenden Studie mit den Kooperationspartnern (Barbara Wallner, Simone Reiter) gefunden roan spezifischen Haplotypen im KIT Gen steht eine umfassende Datenlage zu Verfügung, die zur Vertiefung des genetischen Hintergrunds bzw. dem Auffinden der kausalen Mutation/en führen könnte.

Praxisrelevanz

In Hinsicht auf die Tiergesundheit der beiden gefährdeten österreichischen Nutztierrassen Lipizzaner und Noriker stellen die Projektinhalte konkrete tierzüchterische Lösungen dar, die in der Praxis benötigt werden. Die genauere genomische Charakterisierung von Roan und Fuchsfarbe ist durch den hohen Stellenwert, den Haflinger und Noriker in der österreichischen Pferdezucht haben, von hoher zuchtpraktischer Relevanz.

Berichte

Abschlussbericht

Die Autoimmunerkrankung Vitiligo wird durch den Verlust bzw. die Destruktion von Melanozyten verursacht und resultiert in flächiger Depigmentierung der Haut rund um Augen, Maul und Perianalregion. Diese Art der Pigmentierungsstörung wird vor allem bei Pferden mit Schimmelfarbe in einer Prävalenz von 26-67% beobachtet. Bei normal gefärbten Pferden (Nicht-Schimmeln) ist die Prävalenz mit 0.8-3.5% wesentlich geringer. In diesem Forschungsprojekt wurde erstmal eine genomweite Assoziationsstudie für diese Hauterkrankung beim Lipizzaner durchgeführt, wobei deren mögliche genetische Ursache auf sieben Kandidatengene an vier Chromosomen (ECA1, ECA13, ECA17, ECA20) eingegrenzt werden konnte. Vier der identifizierten Gene PHF11, SETDB2, CARHSP1 und LITAFD, spielen essentielle Rollen bei Immunreaktionen, und die weiteren Gene RCBTB1, LITAFD, NUBPL und PTP4A1 sind in Prozesse der Tumor Suppression und der Tumor Metastase involviert. Vitiligo ist bekanntermaßen ein Gegenspieler der Melanomatose, da die Depigmentierung an typischen Melanom Prädilektionsstellen wie Augenregion, Maulregion auftritt. Dieser Antagonismus unterstützt die mögliche Involvierung der Gene RCBTB1, LITAFD, NUBPL, and PTP4A1 in den Depigmentierungsprozess, während die Prozesse der Gene PHF11, SETDB2, und CARHSP mit der gegenwärtig vertretenen Immun Regulations Theorie der Vitiligo Ethiologie übereinstimmen. In einer zweiten Studie in diesem Forschungsprojekt, fokusierten wir uns auf die genetischen Ursachen der equinen Melanomatose beim Lipizzaner. Die Melanomprävalenz beim Schimmelfarbenen Lipizzaner erreicht 50% und mehr. Bislang haben mehrere Studien eine generelle genetische Melanomprädisposition beim Lipizzaner nachgewiesen, die durch die 4.6 kb lange Duplikation im Intron 6 des STX17 Gens und dessen umgebenden Haplotyp verursacht wird. Dennoch konnten die genaueren Mechanismen, die für die Unterschiede der Etiopathogenese der Melanomatose verantwortlich sind, noch nicht gelöst werden. In diesem Forschungsprojekt konnten wir erstmals eine Genomweite Assoziationsstudie zur Melanomatose beim Lipizzaner durchführen und damit ein Kandidatengen auf Chromosom 24 identifizieren. Das Gen DPF3 ist in Prozesse des Zellwachstums, der Profiferation, der Apoptose und der Motilität von Krebszellen involviert, und es konnte gezeigt werden, dass es auch den JAK2/STAT3 signaling pathway aktivieren kann, der eine zentrale Rolle in der Tumorgenese und bei Autoimmunerkrankungen spielt. Mit einer Replikationsanalyse bei 1.210 Pferden aus sieben Rassen konnten wir demonstrieren, dass der G/G Genotyp des mit DPF3 assoziierten SNPs mit einer möglichen Melanom Supressor Rolle assoziiert ist. DPF3 repräsentiert somit ein Kandidatengen, das für Pferde mit Schimmelfarbe unterstützend wirkt mit der hohen genetischer Tumorlast auszukommen. Die dritte Studie dieses Forschungsprojekts widmete sich der Permanentschimmelung, im Englischen auch Roan-Färbung genannt. Der genetische Hintergrund der Permanentschimmelung beim Pferd wurde bislang von mehreren Autoren bei den Rassen Belgier, Shetlandpony, Gotlandpony, Noriker, Murgese, Slowenisches Kaltblut, Quarter Horse und Islandpferd untersucht, wobei eine kausale Variante bis dato noch nicht entdeckt werden konnte. In dieser Arbeit wurden fünf der bekannten Assoziationen im KIT Gen in einer erweiterten Stichprobe von 37 Permanentschimmeln und 23 Nichtschimmeln der Rassen Noriker, Murgese, Shetlandpony, Quarter Horse, Welsh Pony, Posavina, Slowenisches Kaltblut und Islandpferd genotypisiert, überprüft und mit einer neuen beim Islandpferd publizierten KIT Variante verglichen. Die Ergebnisse dieser Arbeit legten nahe, dass die Assoziation des SNP in Intron 17 (ECA3:g.79,543,439A > G) mit der Permanentschimmelung/Roan-Färbung beim Noriker und den mit ihm genealogisch verwandten Pferderassen (Slowenisches Kaltblut, Murgese, Belgier) komplett ist. Beim Islandpferd konnte gezeigt werden, dass die KIT Variante in Intron 1, nicht wie bislang bei den genannten Rassen beobachtet, mit den Varianten in Intron 17, Exon 19, und Intron 20 gekoppelt war. Beim Shetlandpony waren alle Marker monomorph. Mit der Assoziation im Intron 1 beim Islandpferd konnte die bislang vertretene Hypothese der Rassenspezifischen allelischen Heterogenität des RN Locus bekräftigt werden. Um die Frage der allelischen Heterogenität des RN Locus zu klären, wäre unter der Voraussetzung der Gesamtsequenzierung der KIT Region eine Populationsspezifische Durchführung von Assoziationsanalysen bei Kleinpferderassen nordischen Ursprungs und ein Abgleich mit Warmblutpferderassen Zielführend. Zusammenfassend konnten in diesem Forschungsprojekt mehrere Kandidatengene identifiziert werden, die mit den Hauterkrankungen Vitiligo und Melanomatose beim Lipizzaner in Zusammenhang stehen. Die Ergebnisse stellen somit neue Ausgangspunkt für die Melanomforschung beim Pferd dar. Im Falle der Permanentschimmelung konnte der von Grilz-Seger et al. (2019) entdeckte genetische Marker für die Rassen Noriker, Murgese, Quarter Horse und Slowenisches Kaltblut verifiziert werden und gleichzeitig die Theorie der Populationsspezifischen Allelischen Heterogenität des Roan Locus bekräftigt werden.

Anhänge

Dateiname

BMLRT_Endbericht_Farbgen_II_ktd (1).pdf

Beschreibung

Endbericht Forschungsprojekt Farbgen2

Abstract (deutsch)

Die Autoimmunerkrankung Vitiligo wird durch den Verlust von Melanozyten verursacht und resultiert in flächiger Depigmentierung der Haut rund um Augen, Maul und Perianalregion. In diesem Forschungsprojekt wurde erstmal eine genomweite Assoziationsstudie für diese Hauterkrankung beim Lipizzaner durchgeführt, wobei deren mögliche genetische Ursache auf sieben Kandidatengene an vier Chromosomen (ECA1, ECA13, ECA17, ECA20) eingegrenzt werden konnte. Vier der identifizierten Gene PHF11, SETDB2, CARHSP1 und LITAFD, spielen essentielle Rollen bei Immunreaktionen, und die weiteren Gene RCBTB1, LITAFD, NUBPL und PTP4A1 sind in Prozesse der Tumor Suppression und der Tumor Metastase involviert.

In einer zweiten Studie fokusierten wir uns auf die genetischen Ursachen der equinen Melanomatose beim Lipizzaner. Bislang haben mehrere Studien eine generelle genetische Melanomprädisposition nachgewiesen, die durch die 4.6 kb lange Duplikation im Intron 6 des STX17 Gens verursacht wird. Die genaueren Mechanismen, die für die Unterschiede der Ätiopathogenese der Melanomatose verantwortlich sind, konnten bislang nicht beschrieben werden. Wir konnten hier das Gen DPF3 auf Chromosom 24 identifizieren, das in Prozesse des Zellwachstums, der Profiferation, der Apoptose und der Motilität von Krebszellen involviert ist. DPF3 repräsentiert ein Kandidatengen, das für Pferde mit Schimmelfarbe unterstützend wirkt mit der hohen genetischen Tumorlast auszukommen.

Die dritte Studie widmete sich der Permanentschimmelung, im Englischen Roan-Färbung genannt. Hier wurden fünf der bekannten Assoziationen im KIT Gen in einer erweiterten Stichprobe von 37 Permanentschimmeln und 23 Nichtschimmeln der Rassen Noriker, Murgese, Shetlandpony, Quarter Horse, Welsh Pony, Posavina, Slowenisches Kaltblut und Islandpferd genotypisiert, überprüft und mit einer neuen beim Islandpferd publizierten KIT Variante verglichen. Die Ergebnisse dieser Arbeit legten nahe, dass der von Grilz-Seger et al. (2019) entdeckte genetische Marker in Intron 17 (ECA3:g.79,543,439A > G) mit der Roan-Färbung beim Noriker und den mit ihm genealogisch verwandten Pferderassen (Slowenisches Kaltblut, Murgese, Belgier) komplett assoziiert ist. Beim Islandpferd war die KIT Variante in Intron 1 nicht mit den Varianten in Intron 17, Exon 19, und Intron 20 gekoppelt. Mit der Assoziation im Intron 1 beim Islandpferd konnte die bislang vertretene Hypothese der Rassenspezifischen allelischen Heterogenität des RN Locus bekräftigt werden.

Abstract (englisch)

In horses, the autoimmune disease vitiligo is characterized by the loss of melanocytes and results in patchy depigmentation of the skin around the eyes, muzzle and the perianal region. In the current study, we performed a genome-wide association analysis in 151 Lipizzan horses and subsequently identified seven candidate genes on four chromosomes (ECA1, ECA13, ECA17, ECA20) putatively involved in vitiligo pathogenesis in gray horses. The highlighted genes PHF11, SETDB2, CARHSP1 and LITAFD, are associated with the innate immune system, while the genes RCBTB1, LITAFD, NUBPL, PTP4A1, play a role in tumor suppression and metastasis.

In a second study we focused on the genetic background of equine melanomatosis. Several studies have documented a genetic melanoma predisposition which is referred to the 4.6 kb duplication in intron 6 of STX17. However, the genetic background and mechanisms responsible for differences in etiopathogenesis of equine melanomatosis remain unknown. In the current study, we performed a genome-wide association analysis in 141 Lipizzan horses and identified one candidate gene on chromosome 24 putatively involved in melanoma pathogenesis in gray horses. The associated SNP in the intronic region of DPF3, is involved in cell growth, proliferation, apoptosis and motility of cancer cells. As a conclusion DPF3 represents a candidate gene, which might play an essential role for gray horses coping with high genetic melanoma related tumor load.

In the third study we aimed to explore the complex genetic background of roan coat color, which previously has been investigated by multiple authors. Therefore we genotyped five associated variants in the KIT gene for a sample of 37 roan and 23 non-roan horses from the breeds Noriker, Murgese, Shetlandpony and Icelandic horse, in order to verify and compare them to a newly published KIT variant of the Icelandic horse. Our results propose, that the marker in Intron 17 (ECA3:g.79,543,439A > G) published by Grilz-Seger et al. (2019) is completely associated with roan coat color in the Noriker breed and breeds that are genealogically related to it (Slovenian Coldblood, Murgese, Belgian draught horse). For the Icelandic horse, it was shown, that the KIT variant in intron 1 was not linked to the four loci in intron 17, exon 19 and intron 20 of KIT. The newly associated KIT variant in intron 1 in the Icelandic horse supports the hypothesis of allelic heterogeneity of the roan locus reported by previous studies.

Autor/innen

Thomas Druml

Publikationen

Alle Publikationen wurden vom Projektverantwortlichen eingetragen und liegen in dessen Verantwortung.

Thomas Druml, Gottfried Brem, Michaela Horna, Anne Ricard and Gertrud Grilz-Seger (2021). DPF3, A Putative Candidate Gene For Melanoma Etiopathogenesis in Gray Horses (Journal of Equine Veterinary Science 108 (2022) 103797). .

Thomas Druml, Gottfried Brem, Brandon Velie, Gabriella Lindgren, Michaela Horna, Anne Ricard and Gertrud Grilz‑Seger (2021). Equine vitiligo-like depigmentation in grey horses is related to genes involved in immune response and tumor metastasis (BMC Vet Res (2021) 17:336). .

Thomas Druml, Matjaz Mesaric, Marko Cotman, Barbara Wallner, Gottfried Brem und Gertrud Grilz-Seger (2022). Hinweise auf Allelische Heterogenität im KIT Gen bei der Permanentschimmelung/Roan-Färbung des Pferdes (Züchtungskunde 94). . (0044-5401).