BAKT.WEIN: Identifizierung von Essig- und Milchsäurebakterien

Identifikation der Essigsäurebakterien: Es wurden 84 Bakterien aus fünf verschiedenen Jungweinen, die bei 28°C inkubiert wurden, isoliert. Diese wurden mit biochemischen, wie auch mit molekularbiologischen Methoden auf ihre Zugehörigkeit zur Familie der Essigsäurebakterien untersucht. Im Speziellen ob sie den Gattungen Acetobacter, Gluconacetobacter und Gluconobacter angehören, da diese, laut Literatur für den Verderb von Wein relevant sind. Die Stämme wurden auf ihre Fähigkeit aus Ethanol Essigsäure zu produzieren und diese weiter zu Kohlendioxid und Wasser zu oxidieren getestet. Weiters wurden noch Tests durchgeführt um festzustellen, ob es sich um Gram-negative Bakterien handelt und ob sie Aerobier sind. Auch ob sie die Fähigkeit besitzen aus D-Glukose und D-Fruktose Säure zu bilden und Glyzerin als Nahrungsquelle zu verwenden, wurde geprüft. Nach Beendigung dieser Tests konnte festgestellt werden, dass es sich bei allen Stämmen um Essigsäurebakterien handelt. Außerdem konnte eine Zugehörigkeit zur Gattung Gluconobacter ausgeschlossen werden, da alle die Essigsäure weiteroxidieren konnten. Für die molekularbiologischen Tests wurde aus allen Stämmen und zusätzlich von sechs Referenzstämmen die DNA gereinigt und mit dieser wurden dann die PCRs durchgeführt. Insgesamt wurden sieben verschiedene Primerkombinationen für die PCRs verwendet. Die Primer stammten großteils aus der Literatur und teilweise wurden sie selbst entwickelt. Da die Ergebnisse der PCRs alleine keine Aussagekraft haben, wurden Restriktionsschnitte der PCR-Produkte angeschlossen. Bei den Restriktionsverdauen stellten sich eigentlich nur zwei Primer-Enzym-Kombinationen als verwendbar heraus. Eine stammt von Poblet et al.44 und ist schon veröffentlicht, die zweite ist neu. Allerdings zeigten die beiden ein unterschiedliches Bild. Bei der ersten Methode konnten die Stämme den Referenzstämmen zugeordnet werden, bei der zweiten nicht. Um Klarheit zu schaffen, wurde ein Teil der Proben sequenziert. Es wurden wieder PCR-Produkte hergestellt und diese mit verschiedenen Primern an eine Firma übergeben, welche die Sequenzierung durchführte. Die erhaltenen Sequenzen wurden in zwei Online-Sequenz-Datenbanken eingegeben und von diesen mit den schon vorhandenen Sequenzen verglichen. Dabei kam es zu folgendem überraschenden Ergebnis: Die isolierten Essigsäurebakterien gehören vermutlich hauptsächlich Arten an, die bis jetzt im Zusammenhang mit österreichischem Wein bzw. Essig noch nicht beschrieben wurden. Zum Beispiel Acetobacter tropicalis, eine in Indonesien isolierte Essigsäurebakterien-Art. Identifikation der Milchsäurebakterien: Proben von den bereits vergorenen Mosten wurden gezogen und auf für Milchsäurebakterien geeignete Nährböden (mod. Rogosa Agar nach Pilone et al. 1966, MRS) ausgestrichen. Ein Teil der Bakterien konnte schon nach dem Katalase-Test ausgeschlossen werden, da es sich nicht um anaerobe Bakterien handelte. Weiters wurden die Bakterien auf ihr Verhalten nach Gram untersucht. Von jenen Bakterien bei welchen es sich wahrscheinlich um Milchsäurebakterien handelt wurden Cryostocks angelegt, um auch später auf die Originalstämme zurück greifen und um diese genauer identifizieren zu können.